一、采集标本
以无菌棉拭子蘸取腹泻病患者粪便,如无粪便,以浸湿磷酸盐缓冲液的直肠拭子插入肛门4~6cm(婴幼儿2~3cm)处,在直肠内旋转擦取直肠表面黏液后取出,盛于运送或保存液中,如不能及时送检,样品应在4℃冷藏保存,但以不超过8h为宜。
二、增菌和分离培养
对于大肠埃希杆菌的分离应在初代分离时选用弱选择性培养基,如伊红亚甲蓝,中国蓝蔷薇酸式山梨醇麦康凯平板,划线分离,35~37℃培养18~24h后,观察菌落形态特征,选取紫红色或暗红色,大小1~3mm,边缘整齐有光泽,中央凸起的单个菌落进行鉴定。
三、鉴定
1、初步鉴定:根据菌落特征,涂片染色的菌形及染色反应,取纯培养物细菌作生化反应,凡符合相应结果可初步鉴定为大肠埃希杆菌。
2、最后鉴定:一般常规检验做到上述初步鉴定即可,必要时可按《伯杰系统细菌学手册》所列生化反应做出最后鉴定。
3、鉴定试验:某些大肠埃希杆菌,尤其是无动力的不发酵乳精株,应与志贺菌相鉴别,二者的主要鉴别试验可用醋酸钠和葡萄糖铵利用试验及黏质酸盐产酸3种试验,大肠埃希杆菌均为阳性,而志贺菌为阴性。
(1)致病性大肠埃希杆菌:
A、假定试验:于鉴别平板上菌落生长稠密处挑取培养物,以EPEC的3种多价O血清作玻片凝集试验,如与某一种多价O血清凝集,再与该多价血清所包含的O单价血清做试验,如与某个O单价血清凝集,再挑取3~5个单个菌落,与该血清作凝集试验。
B、生化试验:选择O单价血清强凝集的菌落接种三糖铁琼脂,悬挂靛基质试纸片,经36℃培养18~20h,凡是乳糖,蔗糖产酸,葡萄糖产酸并多数产气,H2S阴性,靛基质阳性的菌株,可证实为大肠埃希杆菌,如果靛基质为阴性时,还必须V-P试验为阴性,且不能在西蒙枸橼酸盐琼脂上生长,方可证实为大肠埃希杆菌。
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